кейбір бағдарламалық қатырушы приборлардың техникалық с и п а т т а м а л а р ы.

 

 Ооциттарды және ұрпақтарды қатыру.

 Практика жүзінде салқындатып-қатыру үшін екі тәсіл қолданылады.

1. Бір этапты. Бұл тәсілде эмбриондр баяу салқындатылып – 70-ге дейін. Бұл процесс клеткаларды қатты мұз күйіне әкелумен толады.

2. Екі этапты. Бұнда эмбриондарды 0,3-0,5 С жылдамдықта салқындата бастайды, осы режиммен –40С температураға әкеледі. Соңында оларды сұйық азотқа батырып, сонда ұстайды. Бұл тәсілде эмбрион жасушаларының толық дегенерациясы болмайды.

Қатыру және еріту жұмыстарына байланысты процестерді мынадай схемасымен белгілеуге болады:

1-корпусы; 2-эллипс сияқты орын, пробиркаларды сыйғызуға арналған; 3-ұстауышы; 4-құралды Дьюара ыдысына фиксациялау үшін жасалған имек /крюк/; 5-пробиркаларды құралда сыйғызу пішіні.

1. Ампулаларға /1-2/не пайетталарға арнайы сиялармен белгі салып жазылады, сосын оларды 150 С қыздырып 90 минут бойы залалсыздандырады.

2.Ампулаға 0,15 мл орта құйылады /РВ, не РА-1 не М-2-4,6 кесте/ және эмбриондарды /30жуық/ салады.

3. Мұзды моншада 0С дейін 10 минут бойы салқындатады.

4. осы ампулаға 0,15 мл 3 м ДМСО 5,6 кестеде көтсетілгендей схема бойынша құралып қойылады, одан әрі ампулаларды эмбриондармен моншаға сидинг болу үшін –8С температурада ұстайды.

5.2 минуттан соң ситинг процесін индукциялайды /5.6 кесте/, ал 5 минуттан  соң үлгіні қоймалжың мұзды қалпымен салқындатушы моншаға –6 С әкеледі.

6.0,3-0,5 С /мин –40^оС дейін/ екі этапты тәсіл, не 70^оС төмен, бір этапты тәсіл температура салқындатады.

7. Үлгіні сұйық азотқа батырып одан әрі салқындатады және сақтайды 15 минуттан соң іскектің көмегімен /алдын ала сұйық азотта суытқан/ контейнерді азотқа батырып сқтауға жібереді.

8. Еріту процесіне кіріседі. Егер екі этапты қатыру тәсілін қолданса, ампуланы сұйық азоттан алып, 50^оС /мин жылдамдықпен қыздыру арқылы, 40^оС температурадағы суда 30-40 секунд ұстайды. Осыдан соң, эмбриондары бар ампуланы бөлме температурасында /18-20^оС/ұстайды. Егерде бір этапты тәсілді қолданса, онда үлгілі баяу жылытумен 4 – тен 20^оС аралығында ерітеді. Пробирканы салқындату үшін /ішкі диаметрі 35мм, биіктігі 200 мм/ сұйық азотты пайдаланады да, оның жылыту жылдамдығы  шамамен 10 ^оС/мин,ол 10-14 мин бойы ерітіледі. Мұздың бәрә тегіс еріп болған соң, үлгіні 5 минут бөлме температурасында ұстайды.

9. ДМСО, не криопротекторды ортада  кетіруге тырысады, ол үшін 5.6 кестеге назар аударса болады.

10. Дюльбекке ортасын эмбриондардың тіршілік қабілеттілігін морфологиялық структуралары критериясымен бағаланады. Сосын аса құнды және құнжы деп бағаланған ұрпақтарды реципиенттерге көшетеуге пайдаланады.

Бағдарлаудың барлық операциясы микроскоппен жүргізіледі. Сонымен, ооциттарды және ұрпақтарды консервациялауда және олардың бұл процедурадан соң жақсы сақталып, арғы өмірінде тіршілігінің ойдағыдай болуына төмендегі жағдайларды орындаса, ұзақ уақытқы сақтау тәсілінің технологиялық процестері дұрыс бғытта дамиды:

- сұйылтқыш құрамы, ооцит және эмбриондар концентрациясын шамамен тыс арттырмау керек;

- криопротекторлардың түрін дұрыс таңдап, олардың концентрациясы ортада мөлшерлі болуы керек;

- температуралық режим ұзақтығы және қалыпты жағдайда қалуы /эквилибрация/;

• салқындату және еріту режимін керекті жағдайда ұстау;
• ерітуге арнайы ертінді ортаны қолдану керек;
• криопротекторларды  кетіру тәртібін сақтау керек.

Витрификация.

Өте жоғары  жылдамдықта қатыруда /5000^оС-мин/ судың молекулалары үлгере алмайды және кристалл торлары  пайды болмайды. Бұл жағдайда су кристалдарға айналмай, аморфты жағдайға, немесе әйнек тәрізді тегіс мұзға айналады. Осы физикалық процесті витификация деп атайды. Бұл құбылысты 1937 жылы алғаш жазған американ зертеушісі B.Zuyet.

Витрификация құбылысы шапшаң және қарапайым түрде ұрпақтарды криоқорғаушылықпен қамтамассыз етеді, сидинг жасаудың қажеті болмайды, яғни эмбриональдық керегі болмайды. Сондықтан витрификациялардың эмбриондарды криоқорғаушылардағы әрі шапшаң , әрі қарапайым. Бірақ, қайта еріту кезеңді, -100 ^оС-ден -250 ^оС дейінгі аралықта /әйнек тәрізді мұз болудың тұрақсыздық кезеңі/ девитрификация /рекристализация/ процесі жүреді, яғни кристалдардың пайда болуын және іріленуін айтады. Сондықтан, девитрификация болмауы үшін, жылыту процесі өте шапшаң жүруі керек.

Осыны болдырмаудың әдістері төмендегідей:

- витрификациялық ерітіндінің құрамы /4.6 кесте/. Эмбриондар витрификациясысуспензиялық алу үшін 90% ВР-1 ертіндісін пайдаланады, себебі, криопротекторлар концентрациясының бұл жағдайда токсиндігі төмен болады /1 кесте/.

-витрификациялық ертіндіде эмбриондардың осмостық қысымын теңестіру үшін /эквилибрация/ қолданылатын процедуралар. Теңестіру бөлмелік температурада, 25% РВ-1 ертіндісінде жүргізіледі, сосын 4^оС температурадағы витрификациялық жоғарғы концентрациясын екі мәрте пайдаланады.

 

1. Ооциттарды және эмбриондарды витрификациялау жұмысының схемасы.

р/н

Жұмыстың  процедуралық ағындары

1.     2.   3.     4.           5.   6.

Эмбриондарды микропипеткамен 3 мл 25% ВР-1 ертіндісінде ұстайды, мұқият араластырады, 15 мин күтеді де үлгілі салқын бөлмеге, не тоңазытқышқа қояды /2-4 оС /. Аз ғана көлемді 25% ВР-1 эмбриондарымен 3 мл суытылған 50% ВР-1 ертіндісіне әкеледі, мұқият араластырады, 10 мин күтеді. Осы эмбриондар үлгісін 90% ВР-1 2см столбик тәрізді етіп, ВР-1 ертіндісі бар паетаға енгізеді. Сосын паетаны екі ұшынан жауып герметикалығын сақтайды. Осыдан соң паетадағы эмбриондарды  20С/мин жылдамдықта суыта бастайды. Практик жүзінде салқындатудың үш тәсілін қолданады:а) сұйық азотта; б) азот буында /шамамен 150оС/ бұл жағдайда үлгіні қатыратын прибордың мойнында жүргізеді  /-200оС/мин/; в) алғашқыда изопентан моншасында /-20оС/мин/, сосын сұйық азотта минутына 120 с температурада ұстайды. Витрификацияланған ұрпақтарды сұйық азотта сақтайды температурасы –196С. Еріткенде шапшаң режимді қолданады: ол үшін қатырылған эмриондарды сұйық суға / 40С / салады, бұл уақытта еріту жылдамдығы 2000 С/мин болады. Еріген таетаның ұштарын қияды. Эмриондардан витрифмкациялық ерітіндіні кетіреджі. Ол үшін екі тәсілді қолданады: а) баяу басқыш процедуралы /1985 /; б) шапшаң        “ қантсахароза ” ерітіндісінің процедурасы / 1984 /.

 

Оған кіріспес үшін / витрификация үшін / төрт түрлі сұйытылған ВР-1 бастапқы ерітіндісін НВ – 1 қолдану арқылы дайындайды:

Ескерту:  *   -25% ВР – 1 /1 ВР N: 3 бөлік НВ 1/

                **    -50% ВР – 1/1 бөлік ВР N:1 бөлік НВ 1/

                ***  -90% ВР – 1 /1 бөлік ВР N:1 бөлік НВ 1/

               ****   -12,5% ВР – 1/1 бөлік ВР N:1 бөлік НВ 1/50% және  90% ВР1 4⁰С дейін сақталынады.

Пайета үшін 0,25 см диаметрі пластиктік түтікшелері пайдаланады. Пайетаға 90% ВР – 1 ерітіндісін / 2см / жіберген соң, оны 4⁰С температураға дейін салқындатады.

 

5.8 а. Сұйылту және режим уақыттары.

Сұйылту процедурасы
Басқышты		Сахарозалық
Ерітінді	Сұйылту реж.	Ерітінді	Сұйылту реж.
3 мл 4 С 50%ВР1 3мл 4С 25% ВР1 суспензия сұйық бөлмеге әкеледі 3мл 12,5%ВР1 ВР1, не М2	10мин 10мин 10мин   10мин 10мин	3мл 4С 1,08М сахароза мен ВР1 суспензия сұйық бөлмеге әкеледі ВР1, не М2	5мин   10мин   10мин

 

 

Ұрғашы малдар	Жыныс феномендер ұзақтылығы				Әдебиеттер
	Цикл күн	Күйлеу күн	Әуестік сағ.	Овуляцияның әуестікке қатынаса, сағ.
Сиыр	20-21	2-4	12-24	10-12, әуестік біткен соң	Студентов А.П.,1986
Саулық	16-17	2-3	24-36	24-36, күйлеу басталуымен қоса	Қасымов К.Т., Өтесінов Ж.Ө., 1988 Мұрзаммадиев А.М., Ертаев Е.Е., 1992
Мегежін	20-22	2-3	48-72	36-40, әуестік біткеннен соң	Студентов А.П., 1986 Эрнст Л.К., 1989
Бие	21-27	5-8	74-144	24-36, әуестік басылғаннан дейін	Эрнст Л.К., 1989
Кролик	8-9	3-5	Майығу барлық жыныс уақытында	10 сағ. Контустан соң	Карлсон Б., 1983