ҰРПАҚТАРДЫҢ ҚАТЫРУ КЕЗІНДЕГІ ДАМУ САТЫСЫ

Өте төменгі қатыру техникасындағы негізгі айырмашылығы әртүрлі сүтқоректілердің ұрпақтарының даму стадиясымен ерекшеленеді, яғни сол кезде олар өздерінің тіршілігін, структурасын жақсы сақтайды. Тышқандар және егеуқұйрықтардың ұрпақтары өзінің қалыпыты жағдайын 2-8 бластомерлі стадиясында қатырғанда жақсы сақтайды / Манк М., 1980, Белоус А.М., 1986 /. Криоконсервация дұрыс жүру үшін, криопротектордың орнына диметильсульфооксид / ДМСО /, өте сирек глицеринді қолданған. Кроликтер эмбриондарын қатыруға 8 бластомерлі эмбриондар және морула стадиясы дұрыстығын Tsunda Y., 1977 өз зерттеулерінде келтіреді. Криопротектор үшін ДМСО пайдаланған. Кроликтер эмбриондарын қатыру ісіндегі ең маңызды айырмашылықтың бірі – қатыру – ерітуден кейін оларды in vitro өсірудің қажеті жоқ, реципиенттерге көшеттей береді, ал оған қарағанда тышқандар эмбриондарын көшеттеуден бұрын in vitro жағдайында өсіру керек.

Сиырлар ұрпақтарын криоқатыру процедурасын бластоцияста стадиясында жақсы жүреді, криопротектор үшін 1,5м ДМСО, не 1,0-1,4 м глицеринді пайдаланады. Қой мен шошқалар үшін морула және бластоциста стадиясы жақсы нәтиже береді. Қатыру үшін тек жаңадан алынған эмбриондарды пайдалану керек.

 

Криопротекторлар.

криопротекторлада көптеген химиялық заттардың / кіші молекулярлы электриттер еместе, жасуша мембранасынан ену мүмкіншілігі бар/ болуы қатыру мезетінде эбриондардың тіршілігін сақтауға арналған, себебі олар ұрпақтарды ерітінділердің жоғары тұздар концентрациясынан сақтайды. Оларды қатыру процедурасында физико – химиялық процестердің өзгеруінен, су қатып орта криосақтау заттар класы белгілі / олар жүзден артық / болған / Уббедэде А., 1969 /.

Жасушалар мен криопротекторлар арсындағы қарым – қтынас сипаты бойынша, криопротекторлар екі топқа бөлінеді:

1. жасуша мембранасына еркін енетін – эндоцеллюларлы /ДМСО, глицерин /;

2. жасуша ішіне кіре алмайтындар –экзоцеллюларлық, олар өздері екі топшаға бөлінеді: а) осмостық белсенді / сахароза / және б) осмостық белсенді емес / поливинилпирролидон – ПВП /.

Эндоцеллюларлық криопротекторларды қатырған соң ерітуден кейін жасушаджан шығарудың керегі жоқ. Олардың жалпы негізгі сипаттамасы төрт түрінің ең кеңінен қолданылатындары 5.1.кестеде келтірілген.

Эндоцеллюлярлық криопротекторлардың қорғау әсеріне байланысты екі факторды жіктеуге болады: ерігіштігі азайтады және электролиттер қауыпсыз мөлшеріне дейінсоның әсерінен белоктар компоненттері структурасының денатурациялық ықпалын жұмсартады. Сұйықтың / ортаның / қатты салқындауына және ерітінділерін кіші кристал мұзға айналуына мүмкіншілік туады, молекулярлық массасы кіші болғандықтан олар клеткаға оңай енеді, суды алмастырады және байланыстырады, срнымен қатар, эвтектика нүктесін азайтады, ол жасушада кристализацияның дамуына кедергі келтіреді және жасуша ішіндеқату процестерін майда кристалды мұзға айналдырады. Глицерин – осмостық белсенді зат емес, ол тек кейбір жасушаға ғана қатысы бар клеткадан тасымалданбайды, сол себептен осмос қысымын арттырады. ДМСО артықшылығы глицеринмен салыстырғанда осмос қысымының тепе – теңдігін жасуша мембранасы арқылы тез қалпына келтіреді. Бұл екі криопротектордың кемшілігі реконсервациядан соң, оларды эбриондар жасушаларынан шайып тастаудың қажеттілігі.

ПВП криопротекторларының қасиеттерітөмендегідей: ол астроцеллюлярлық қорғауынан клеткадан тыс суды және жалпы судың кейбір бөлігін өзіне қосып алады, сонымен қатар жасушадан бөлінген суды да мұз криталдарының өсуін кідіртеді, жасушаны сыртынан қорғап қоршайды.

Эндо және экзоцеллюлярлық криопротекторлардың жалпы заңдылығына мыналарды жатқызуға болады: жасуша дегидрациясы, контакт уақытымен концентрация арасында тура тәуелділік болады, цитоплазма вакуолизациясы, ядро пикнозы және басқа цитоплазмалық эффектілер , жасушаның адъгезивтік қасиетін төмендетеді ж.т.б.  Бұның беклгілі бір концентрациялық интервалында криопротекторлардың жасушаларға әсері қайтымды болады.

Криопротекторларды қолдану үшін, төмендегі негізгі қажеттіліктерді естен шығармау керек: олар клеткаға оңай ену керек, тез суды байланыстыра алатын болсын, электролиттердің судағы ерітіндісіне жақсы еру керек, төменгі серпімділік эвтектикулярлық массасы болуға тиіс, үлкен концентрациясында улылығы аз / токчисность /, не төмен болуы керек.

Криопротекторлар ерітінділерін фосфатты тұздар буферінде 10-20% бұзау қан сарысу қоспасымен, не 4% бұқа сарысу альбуминімен дайындайды. Ұрпақтарды криопротекторлар ерітіндісімен екі не 4-5 этапта қанықтырады. Оған дейін оларды 3-5 тамшы криопротекторлар өскіні концентрациясынан өткізеді / 5.2. кесте /.

1м глицерин ертіндісін дайындау үшін глицерин көлемін төмендегі формула арқылы алады:

 Осы есеппен алынған глицерин көлемі 1 литрге дейін жеткізеді.

 

5.3. Криопротектордың эквиваленттік салмағы және көлемі.

Заттар	Крнцентрациясы 1 моль		Концентрациясы 3 моль
	Салмағы,г	Көлемі, мг	Салмағы, г	Көлемі, мг
Глицерин ДМСО	92,1 78,13	73,7 71,0	276,3 234,4	221,1 213,1

 

Әртүрлі концентрациялы ертінділерді пайдаланып, ЗМ негізгі сұйықты дайындау технологиясы.

Криопротекторлар	Заттың сандық керекті мөлшері	Қажетті сұйылтқыштар мөлшері, мл	Ертінділердің жалпы торлар мөлшері, мл
Глицерин       ДМСО	0,045 0,080 1,110 2,210 0,043 0,060 2,130	0,158 0,280 3,890 7,790 0,160 3,940 7,870	0,203 0,360 5,000 10,000 0,203 5,000 10,000

 

Ескерту: сұйылқыш үшін арнаулы орта РВ 1 немесе М2 пайдалануға болады.

 

ДМСО, не глицеринді қатыруға арналған ортамен араласқанда көптеген жылу бөлінеді. Сондықтан эмбриондары бар ортаға ұйытылдмаған ДМСО, не глицерин қосылмайды, оның орнына оның 3. ОМ ерітіндісін дайындайды. Ертінділер дайындау үшін криопротекторлардың салмағы және қажетті көлемі 5.3. кестеде берілген.

Сандық жағынан 3.ОМ криопротекторлар мен арнаулы ерітінділерді қосып, арнаулы ерітіндіерді дайындау технологиясы 5.4. кестеде көрсетілген.

Осы негізгі ертіндіден арнайы керекті концентрациялы ертінді дайындау үшін төменгі формуланы қолданады:

Мысалы, үш М негізгі ертіндіден 0,5 М дайындау үшін, бір ЗМ негізгі ертіндіге фосфорлы – сульфатты буфер / ФСБ / қан сарысу қосылған 5 бөлігін қосады.

5.5.Қажетті концентрациялы ертінділер дайындау.

Қажетті концентрация,М	1 бөлік ертіндіге 3.М / қосылатын сұйытылған мөлшері	Қажетті концентрация, М	1 бөлік 3.М ертіндіге қосылатын сұйылтқыш мөлшері
1,4 1,0 0,75	1,1 2,0 3,0	0,5 0,25 0,1	5,0 11,0 29,0

 

Сонымен қатырып –еріту үшін криопротекторларды пайдаланған эмбриондар тіршіліктері олардың әрі дамып өсуіне әсерлері мынаған байланысты:

1. криопротекторлардың арнаулы ортадағы концентрациясы. Эмбриондарды консервациялап қайта еріткенде криопроектор МДМСО ен оптимальды мөлшері 1,0-ден 1,4М тең болса, ұрпақтардың өсіп-даму тіршілігі ешбір кемімейді екен. Ал, криопроектор, ДМСО және глицериннің ортадағы концентрациясы.

2. ОМ төмен болса сұйықтық “ агенттерден ” қорғау тиімділігі аз, ал олардың концентрациясы ортада тиісінше 2,0 және 1,4М жоғары болса, токсиндік әсері тиеді екен.

3. Процесс, яғни салқындату, қатыру жалдамдығына және сол мезеттегі температураның өзгеруі. Бұдан екі жағдайды еске алады, біріншісі криопроектордың белгілі мөлшерін эмбриондары бар ортаға қосудағы оның температурасы, екіншісі салқындату алдындағы оларды нольдік температураға жеткізу технологиясының экспозициялық уақыты.

4. Криопроекторлады еріткеннен кейін ортада кетіру жылдамдығына және температурасына тәуелділік бар.