ЭМБРИОНДАРДЫ БАҒАЛАУ КОСЕРВІЛЕУ

 

Эмбриондарды жуып алғаннан соң оларды бокс бөлмеге әкеледі де термостатқа 37 градус С ауақытша ұстайды. 20-30 мин өткеннен соң алынған ұрпақтардың бәрі ыдыстың түбіне тұнады. Ортаның жоғарғы жағын алып төгеді, ал төменгі бөлігін эмбриондарды тауып, бағалаудан өткізу үшін порция – порциямен микроскоп арқылы / МБИ – 1,5 әуелі МБС – 9,10 пен / 50 ден 150 – ге дейін үлкейту жүйесімен көреді. Сол уақытта ұрпақтарды бағалайды. Ол үшін қазіргі кезде төрт негізгі тәсілі бар / Эрист Л.К., 1989., Кауффельд П., 1990 /.

1. Морфологиялық тәсіл, ол эмбриондар мембранасы мен бластомерлер структурасын зерттеуге негізделген ( 4.1 сурет Өтесінов Ж. Ө., 1993).

2. Әртүрлі бояулар қолдану / зозин, метилен көгі /. Тәсілдің негізі мынада: тіршілігін жоғалтқан ұрпақтар бояуы жақсы сіңіреді, боялады, ал қалыпты жағдайдағы эмбриондар боялмайды.

3. Арнаулы орталарда өсіру. Оның негіздері эмбриондарды in vivo өсіру үшін / аралық реципиенттерді / организмдерді пайдаланады, не in vitro арнаулы орталарды / газ құрамынан өткізумен 90% O, 5 % N және CO₂   қосындылары / пайдалану арқылы іске асыруға арналған, яғни осы жағдайларда эмриондар тіршілік мүмкіншілігін сақтағандар өзсыз эмриондар өздігінен таңдалып өз дамуын кідіртеді / әсіресе 8 – 16 бластомерлік стадиясында /, ал тіршілік қабілеті жоғары құнды ұрпақтар өсіру уақыттарында бластомерлері екі еселенеді.

4. Цитогенетикалық тәсіл. Бұл тәсіл тотальды препарат дайындауға негізделген / толық эмбриондардан /. Бұл кариотип, хромосомалық аномалияларды анықтауға арналған.

Практика жүзінде – морфологиялық тәсілді пайдаланады. Бағалану критерилері эмриондардың саналы даму кезіндегі уақытша параметрлерді анықтауға, кейбір морфологиялық деффектілерді байқауға арналған. Бір қызығы барлықө анықталған ауытқулардың бәрін деффектіге жібере беруге болмайды, кейбіреулері дұрыс жағдай жасалса қайта өз қалпына келуі мүмкін. Соның бірі бластоцистада қуыстың болмаы да қайтымды. Бұл метод бойынша барлық алынған эмбриондарды үш топқа бөлуге болады:

1. Қалыпты дамудағы ұрпақтар;
2. Дегенерация / өлім – жетім сапасындағы / ұшырағандар;

3. Ұрықтанылмаған жұиыртқа жасушалары. Микроскоптық зерттеулер бойыншаэмбриондарды 4 класқа бөлуге болады / Сергеев Н.И., 1987 /. Олар:

1. КЛАСТЫ эмбриондарға жататындар / өте жақсы /. Ұрпақтарды өз даму уақытына жақсы сәйкес келеді, дөңгелек шар тәрізді, ZP бұзылмаған. Бластомерлі бірдей, контурлары нақты көрініп тұрады және цитоплазмасы бірқалыпты дән тәрізді заттарға толы. Бластоцистада қуысы жақсы көрінеді. Ішкі жасушалар массасы / УЖМ / және трофоэктодерма / ТЭ / айырылып, морфологиялық ауытқулар байқалмайды. ТЭ мөлдір зонасына тығыз орналасқан, ал первителлин кеңістігі өте тар.

2. КЛАСТЫ эмбриондарға жататындар / қалыптылығы жақын /. Дегенерация ұшыраған бластомерлі 30% - ке дейін жетеді. Бластоцистада қуысы жақсы білінбейді, бластомерлі біркелкі емес, орналасуында ассиметрия байқалады.

3. КЛАСТЫ эмбриондарға жататындар / қанағаттандырарлық /. Бластомерлердің бұзылған түрі 50% - тен асады. Ұрпақ формсы бұзылуы мүмкін, тығыздалған тәрізді.

4. КЛАСТЫ эмбриондарға жататындар / жамандары / эмбриондар даму мүмкіншілігін жоғалтқан, мөлдір қабығының сыртқы жарақаттанған, бластомерлерінің формалары өзгерген, арасында байланыс үзілгендер.

Трансплантация 1 және 2 класты эмбриондарды пайдаланады.

 

Эмбриоконсервациялау

Төменгі температурадағы консервация әдісі сұйық азотты қолдануға негізделген. Осы күрделі жұмыстарды іске асыру үшін арнаулы орта құрал жабдық, дәріхимреактивтер арнайы лабораториялық корпус, консервациялауға арналған малшаруашылық биологиялық және медициналық объектілер / ұрық, ұрпақ, қан жасушалары, болашақта қолданатын ағзалар, ұлпалар /, жоғары өз ісінің техник – мамандары.

Эмбриондар және басқа сақтауға жобаланған объектілерден арнаулы банк ұйымдастыру керек. Мал шаруашылығында аса қажетті генотиптерді ұзақ уақытқа сақтау белгіленген, оның себебі, генетикалық контоминацияның, не басқа қауіпті аурулардың салдарынан генетикалық материалдарды жоғалту қорқынышы болмайды, екіншіден жеке малдарды не малдардың топтарын алыс жерлерден әкелумен салыстырғанда мемлекетаралық тасымалдауды жеңілдетеді, арзанғка түседі және жобаларды тез орындау мүмкіншілігі туады, үшіншіден каратиндік шектеулер қаттылағаннан құтылады, өйткені эмбриондарды технологиялық консервациялауға өңдеу барысында микробтардың ере келу мүмкіншщілігі нөлге тең, үлкен мал бастарын жеткізуден гөрі ұрпақтарды қатырған күйінде әкелу арзанға өнімді малдарына селекциялық жұмыстарды жеңілдетеді, шапшаңдатуға үлкен мүмкіншщілік тудырады.

Криоконсервациялық әдісті адам эмбриондарына қолданудың зор пайдасы  - ол бедеуліктің барлық түріне қарсы күрес жүргізуге бағытталған. Әсіресе суперовуляция және in vitro ұрықтандырылу тәсілі көп ұрпақтар алып, оларды консервациялау және қосымша тасымалдау келесі жыныс циклінде қолдануға, таңдап қолдануға мүмкіншілік берсе, бала көтеруге жаңа қуаныштарға ие болуға шек келтірмейді.

Бұл әдіс мал шаруашылығында 1970 жылдары өте кеңінен тарады. Сол жылдары криоконсервация әдісімен, яғни тышқандарға қатты салқындатылған эмбриондарды / -196 градус С / трасплантациялау арқылы, алғашқы тірі жұрағат алынды. Ал қазір кезде бұл әдіс малдардың барлық түріне қолдануда. Қатырып еріткен эмбриондардың алынған төлдері қазір есептей бермейді, себебі бұл тәсіл дүние жүзіне кеңінен тарады деуге болады. Ғылымдардың алдынған тұрған мақсат – көшеттелген эмриондардың тіршілігін арттырып, бұл әдістегі  күрделіліктер мен қиындықтарды жою / Қасымов К.Т., Өтесінов Ж.Ө., 1988., Өтесвінов Ж.Ө., 1987, Тойшыбеков М.М., 1988, Өтесінов Ж.Ө., Асылбеков Г.К., 1995 /.

 

Төмендегі температурада эмбриондар концервациялаудың теориялық аспектілері.

Өте төменгі температурада эмбриондарды салқындатқанда болатын биологиялық  анығында физикалық – химиялық және крибиологиялық процестердің механизмдерін, объектілердің осы қиын жағдайларға көмек беріп, өз биологиялық маңызын сақтап қалып, осы процестері кері жүргенде қалыпты, осы процестері кері жүргенде қалыпты жағдайда өз тіршіліктерін әрі қарай жалғастырып, жұрағатқа дейін дамып, өз тегіне сәйкес төлдік мәнін сақтап, ауылшаруашылығы үшін аса құнды қасиеттерін өзгертпей келесі популяцияға беріліп, өнімділігін сұрыптауға / селекцияға / мүмкіншілігін туғызса онда осы жолды өткендегі қиын да күрделі мәселелер өз шешімінің тиімділігі ақталды деуге болады. Сонымен аса қатты салқындатуға объектінде қандай процестер жүретініне, тіршіліктің кідіріс шегінде метаболикалық реакциялардың ең төменгі мөлшерде жүруіне, анабиоздық құбылыстың механизмдеріне білу, зерттеу оның теориялық мәнін толықтыру, жаңалықтарына үңілу, ашу ғалымдардың  / криобиолоктардың / төл ісі. Сол процестерді білу, әсіресе қатырудың алғашқы этаптарында болатын физико – химиялық және биологиялық өзгерістерді зерттеу үшін термометрикалық тәсілді қолданады / 1сурет /.

Қатыру – еріту процестері жалпы судың физико – химиялық қасиеттерімен анықталады, оның температура салқындағанда айрықша тәртіпте жүретін реакцияларын, кристализация және мұз ерудегі процестердің объектіге түсіретін әсерін, биологиялық өзгеруі мен салқындату шапшаңдығына зер сала білу, қаталдығын азайту мүмкіндіктерін ұйымдастыру қажет.

Клеткаларды аса төменгі температурада салқындатуда, температуралық  интервал  өзгерісін, бірнеше температуралық зоналарға бөлуімізге болады /Осташко Ф.И., 1978/.

-40-тан 25 градус С зат алмасу процесінің ең жоғарғы белсенділікте жүретін зонасы деп есептелінеді;

-25-тен –5 градус С зат алмасу мөлшерінің төмендегіт зонасы және анабиоздық жағдайға өтуге дайындық;

-0-ден –80 градус С төменгі температура зонасы, анабиоздық жағдайлардың өтуі жалғасады, өте салқындату /переохлаждения/, жасушадан тыс және жасуша ішіндегі сулар мен тұздар кристализациясы жүреді.

Жасуша құрамына шамамен 80% су кіреді /мысалы, тышқандардың ұрықтанылмаған жұмыртқа жасушаларында су көлемі 1,88х10мкм мөлшерде болады/,бұнда 10-15% молекулада күшті байланыста болады және үсімейді /невымерзает/. Осы зонада су сұйық кристалды жағдайға келеді. Қату барысында бұл су гексогенальді пішіндегі кристалдарға  айналады, осыған байланысты кристализация білінбейтін /скрытая/ жылу шығарады                  /320 Дж/г/.

-80-нен-150 градус С ультратөменгі температуралық зонасы, бұнда толық кристализация және рекристализациялық процестер жүреді;

 -150-ден –196 градус С –аралығы ешқандай кристализация не кристализациялық процестер жүрмейтін зонаға есептелдеді.

Сондықтан эмриондарды және ооциттарды төменгі температурады қатырғанда қатырғанда мұз кристалдары пайда болуы жасуша аралық кеңістіктерде жүреді. Бұның өзі ортада / в сфере / иондар концентрациясының өсуіне әкеледі, соның салдарынан жасушалар сусыздана бастайды және олардың ішінде тұздар концентрациясы өседі.

Клетканың сусыздануы бір жағынан жасуша ішіндегі судың жоғалуына, жасушалардың қалыпты жағдайдағы белгілі бір қашықтықты сақтауы бұзылып беттесуіне химиялық табиғи заттардың өзгеруінен, тұрақты компоненттердің бір беткейден екінші беткейге тасымалдануына әкелсе, екінші жағынан, бастапқы сусыздану мұз кристалдарының бұзылуынан сақтайды.

Сусыздану иондар концентрациясыныңжасуша ішіндегі өсуі, тек қана белгілі бір мөлшерге дейін тіршілікке дейін сыйымды, шектен өткен соң, барлық биохимиялық процестер қайтымсыз жағдайға келеді. Ал екі факторлы бұзылу теориясына сәйкес бірінші этапқа / 0 ден 7 градусС/ ен теріс әсер ететін фактор, яғни өте шапшаң түрде жасуша дегидротация жүреді, екінші этапта / 7-50 градус  С / тұздар концентрациясының көбеюі өте қауіпті. Бұл екі фактордың әсерлерінің белсенділігі жасуша түріне, консервациялық орта құрамына және салқындату жылдамдығына тәуелді. Сондықтан, бірінші этапта салқындату жылдамдығын теженкіреген дұрыс болса, екінші этапта гиперконцентрациясының әсерін азайтуға тырысу керек.

Өте төменгүі температурадағы клеткаға тигізетін әсерлерінен белгілі бір реттілікпен криозияндылықтар дамиды:

1. Гидрофобтық қарым – қатынастың әлсіреуі және сұйық кристалдық жағдайына фазалық түрде өтулері, одан басқа, мембраналар структурасында әжептеуір өзгерістер жүреді, екінші кластерлердің пайда болуы / қысқа уақытқа пайда болатын липидтер молекуласы/. Липидтердің кластер жағдайына өтуі белоктармен қатынасын бұзады және ферменттер жұмыс дискоординацияланады, үшінші, литеральдық бөліну жүреді; төртінші, белоктарда қайтымды не қайтымсыз өзгерістер болуы мүмкін;

2. Физико – химиялық факторлар өзгерісі-рН, электролиттік концентрациясы көбейеді, осмос қысымы жоғарылайды;

3. Биохимиялық өзгерістер – липидтердің тотығуынан белсенділігі артады, сульфитті сутегі тотығады / сусызданғанда белок молекулалары бір – біріне жақындайды және десульфитті S-S байланысы, SH топтарының тотығуынан пайда болады, дитиол десульфиттік SH – ды S-S белок денатурациясына алып келеді /, фосфолипазды активтейді, тыныс алу әртүрлі болады / өттегі алмасуы бұзылады / және фосфорланулар ритмі бұзылады.

Кіші жасушалар қатырудан оңай өтеді, өйткені олар шапшаң сусызданады, сондықтан олар гипертониялық ерітінділердің зиянды әсерлері аз болады. Сол сияқты, салқындатқан жасушаларды қайта еріту процестерінің өте күрделі екенін ұмытпау  керек, өйкені кристализациялық процестерде осмос қысымының өзгеруі мембранарға қатты әсерін тигізеді, әсіресе клетка көбею звеньесіне. Еріту кезеңіндегі ең қалыпты  зоналары –50 градус – ден 30 градус-ға дейін және 30 градус-дан  0 градус –ке дейінгі аралықта / Бугров А., 1977/. Эмбриондар жасушаларының зақымдануы, олардың көлемінің кризисі максималдылығынан ісінуінен болады, әсіресе изото-никалық дәрежеге қайту мезгілінде өте қауіпті.

Сонымен, айтылған тәсілдің, яғни эмбриондарды өте төменгі температурада салқындатудың уақытқа қатысымен үш этабын айтуға боладжы: салқындату, қатыру және еріту. Бірінші этаптағы / 37 гүрадус С – тан  кристализация нүктесіне  дейін / негізгі факторы жылуды жоғалтуы, срнының салдарынан зақымдануы температуралық шокпен байланысты. Бұл этапта керекті нәрсе баяу салқындату. Екінші этабында / қатыру / негізгі зақымданулар жасушадан тыс себебі тұздар гиперконцентрациясы қатты ықпалын тигізеді, гидротация әсерінен жасуша көлемі азаяды, рН көрсеткіші жылжиды.

Осы этапта аса қажетті нәрсе, екі этапты бағдарламамен салқындату. Алғашөқы салқындату жылдамдығы 10 градус С / мин аспау керек, содан кейінгісі – минутына 100градус С – пен жүреді, ал үшінші этаптағы жасушалардың зақымдануы / жылынып кетуінен – отогрев / рекристализациялану мен осмос қысымының әсерінен болакды. Еріту жылдамдығы қатыру жылдамдығымен сәйкес болуы керек /Курбатов А.Д., 1988, сурет /.

 

Сурет. Температуралық өзгеру сипаты:

                   О-судың қату температурасы / 0⁰С/

                   В- ірітіндінің қату температурасы

                    К-кризистік температура

                    S-өте қатты мұздау мөлшері

                    КВ-температура шапшауы

Бұл термограммадан өте қатты мұздаудың мөлшерін айыруға болады, сұйықтың мұзға өту алдындағы фазасын / Т₂ – Т₁ / және осы периодтың ұзақтығын / t₀ – t₁ /, екінші өте қатты мұздаудан соң температура шапшуын байқауға болады. Бұл кезде көрінбейтін / білінбейтін / жылу бөлініп кристализациялынады және оның ұзақтығын байқауға болдаы. Кристалдық торлардың пайда болуы тек қана тұрақты температурада / температуралық қисық графигі платосы, ВС кезінде /t₃ – t₂ / периодты аралығында.