ЭМРИОНДАРДЫ ӨСІРУ

Ұрпақтарды өсіруге жасанды орталар.

Эмбриондарды  донорлардың генеталии аппаратынан жуып алғаннан соң, олардың тіршілігін жалғастыру үшін арнаулы орта керек. Оның компоненттері эмриондардың уақытша сақталуына ғана мүмкіншілік туғызбай, олардың дамуын табиғи ортаға / In vivo / өте жақын болған да ғана қамтамасыз етеді. Міне, осы жағдай жасанды ортада сақталуы тиіс, сонда ғана ұрпақтар табиғи дамуын жалғастырып, еш кідіріссіз пролиферация және дифференцировкалар жүре береді.

Жасанда ортаның басқа қызметтеріне жататындар: 1. эмриондарды қоректік заттармен қамтамассыз ету; 2. физико – химиялық қасиеттерін сақтау / рН, осмостық қабілеті /; 3. гормональдық ламу факторларымен қамтамасыз ету; 4. гормондар, минералдық заттарды, витаминдерді, липидтерді, ж.б. тасымалдайтын арнаулы белоктардың болуын қамтамасыз ету.

Жасанды орта жасау үшін, әуелі қан плазмасын және басқа биологиялық сұйықтарға анализ жасау арқылы қажетті сұйықтық компоненттерін табады / өз уақытында 199 компонентті орта жасалды. Могдан Ж.Ф., 1950 /. Жасанды ортадағы қан сарысуын алмастыру үшін, үш бағытта зерттеулік жұмыстары жүргізіледі / сандық және сапалық жағынан қажетті заттардың бәрі қаралады /:

1. Анализдік тәсіл. Қан сары суын бөліп алып, идентификациялау / жұмыс көп /;

2. Ситетикалық тәсіл. Сато қызметкерлерімен негізгі қоректік сұйықтыққа өсіретін әртүрлі комбинациялық факторларды қосты / олар сывородка қызметін жасаушылар /: митогендер, транспорттық белоктар ж.б.;

3. Хем өз қызметкерлерімен ұсынған тәсіл. Бұл тәсілдің негізі, қан сары су концентрациясын жасанды ортадан бірте – бірте азайтумен, клеткалар пролеферанциясы тоқтағанға дейін зерттейді. Сосын әр жасанды орта компоненттері концентрациясын / амин қышқылы, витаминдер, гармондар ж.б. / көбейте отырып жасушалардың көбейіп өсі процестері жүргенде тоқтатып, керекті жасанды ортаны тапты.

Жасанды ортаны дайын сұйық күйінде / он есе жоғары концентрациялы /, не ұнтақ парашок күйінде алуға болады. Дегенмен, көп зерттеуші ғалымдар жасанды ортаны өздері жасап алады, себебі, ол әрбір ингридиентті бақылауға мүмкіндік береді.

Жаснды ортаның ең осы ингридиенттері су мен май. Ең дұрысы, инъекциясы және жуып алуға арналған суды қоладу керек, өйткені ол залалсыздандырылған және пирогендік қасиеті жоқ. Май сұйықтың осмолярлық өзгерісін болдырмау үшін керек, ол жағдай ұрпақтарды инкубацияланғанда, судың буланып азаюынан болады. Жасанды ортаның осмолярлығы 280-285 мосмоль/ л. деңгейінде сақталу керек. Сондықтан жасанды орта суының булануын сақтау үшін, жеңіл парафин майын пайдаланады.

Жасанды ортада энергия көзі есебінде 5-20 мм концентрацияда глюкоза қолданылады, не 0,7-5 мм концентрацияда глютамин қолданылады. Егер глютаминді энергия көзі  есебінде қолданса, көмір сулардың лактатқа айналу дәрежесі төмендейді. Сонымен қатар, глюкоза орнына 2 – 20 мм концентрациялы фруктозаны, не галактозаны пайдалануға болады.

Эмбиондрдың жасанды ортада жақсы дамуын бірден – бір іске асыратын 13 амин қышқылының қажеттілігін және мөлшерін білу /4.2 кесте/. Олардың керекті концентрациясы 0,5-2,0 мм .

Сывородкасыз /қан сарысуынсыз/ ортаға көбіне инсулин қосады /өсуді жүргізеді – обеспечивает рост/, сосын трансфериль де болуы керек. Инсулин ортада тез ыдырайды, сондықтан оның концентрациясы жоғары болғаны дұрыс /1-10мкг/л/, оның ыдырауы ортаның темір иондарымен /Fe+қанығуына / 5 мкг/мл/ байланысты. Ортаның ең қажетті компоненттерінің бірі стероиттық гормондар-/эстрадиолд, прогестерон/ қатысуы.

Ортада бүкіл физиологиялық процестерді жүргізетін, ұрпақтардың ждамуіына үлкен ықпал тигізетін заттар: натрий, калий, кальций, магний, фосфаттар, сульфаттар, биокорбоноттар және қоректер /4.2 кесте/. Бұлардың функциясы ерітіндіде осмос қысыммен, мембранда потенциялын және буферлік есебінен рН реттеуге бағытталған. Ал микроэлементтердің жұмысын бағалау өте қиынға түседі. Микроэлементтердің ортада қатысуы және олардың сапалық құрамы, жасанды ортаға белоктарды және пептиттерді қоспауға мүмкіншілік береді. Қалыпты микроэлементтерден /иондық формдағы/ Fe, Cu, Mn, Li, Mo, B, Ni, Zn,In және /ЗОнМ/ басқа да микроэлементтер ортаға пайдалануда, оған Al, Ag, Ba, Cl, Co, Cz, F, Ce, J, Rb, Zr – ді де қосуға болады.

Барлық жасанды орат құрамында: суда еритін витаминдер, мысалы В тобы витаминдері, биотин фолиев қышқылы, никотинамид, пантотен қышқылы, тиамин, перидоксин, ребофлавин және майда еритін А,С және Е    / токсоферол түрінде, мысалы, 199 ортада / витаминдері болады.

Эмбриондарды өсіруге қажетті оптимальды температура 37-37,5 градус С, рН – 7,2-7,4. ортада көмір қышқыл / СО₂ / газының және 25 мм концентрациялық натри биокарбонаттың қатысуымен рН тұрақты түрде 7,2-7,4 тең болады, оның куәсі ретінде, осы мөлшердегі рН – тың себебінен, қызыл фенол сарғаш – қызыл түсте болады. Көрсетілген рН мөлшерін ортада ұстау үшін HCl децинормальды ерітіндісін пайдаланады / егер сілтілік жағына ауысса / не NaOH пайдаланады / егер орта қышқылдық көрскеткішке ығысса /. Көптеген орталар ауада NaOH әсерінен қажетті рН мөлшерін сақтай алмайды, сондықтан ортаны 5% көмірқышқыл газы қоспасымен эквилибрация жасайды. Бұл газды орта арқылы жібергенде алдын ала фильтрациядан және ылғалдылықтан өткізу керек.

 

2 кесте Жасушалардың тіршілігіне және өсуіне қажетті қан сарысуының басты компоненттері /Маурер,1989/.

Компоненттер

Негізгі функциялары

Белоктар Альбумин      Фибронектин  Мароглобулин Фетуин Траснферин                            Полипептиттер және өсу факторлары Инсулин     Соматометиндер А және С   Тромбоциттер мен синтезделуші өсу фактолары /ТСОФ/ Өсу факторлары: Фибробластар Эпидермистер Эндотелилер Көз жасушаларынан алынған   Пептидтер Глутатион реакциясы                                Басқа гормондар   Кортизол                                                                     Липидтер Линол қышқылы Простагландиндер Холестерия                                                Метоболиттер Аминқышқылдары-кетоқышқылдар /приуват/ Полиаминдер   Минералдызаттар Микроэлементтер

Липидтер, гормондар, минералдық заттарды тасымалдайды. Осмом қысымен буферлілікті ұстайды. Жасушаларды субстратқа жалғайды. Трипсин белсенділігін төмендетеді. Клеткалардың жалғасуын оңайлатады. Байланыстырады.   Митогендер, өсу факторлары І және ІІ ұқсайды. Жасушалардың глюкоза мен амин қышқылдарын жинақтайды. Митогендер, АСР белсенділігін, көбеюін стимульдеушілер. Фибробластар және тегіс ет ұлпаларының жасушаларының митогендері     Митоген Митоген Митоген Митоген   тотығу-тотықсыздану           клеткаларды жалғауға қатысады, жасуша дифференцировкасын индукциялайды. Эстрогендер, андрогендер,метогендер, қалқан без гормондары, тыныс алу, энегетикалық метаболизм. Әртүрлі жасушалар өсуін және дифференцирвкасын жасайды.     Мембрана биосинтезі Мембрана биосинтезі Мембрана биосинтезі     Жасушалар пролеферациясы Жасушалар пролеферациясы   Әртүрлі функциялар оның ішінде ферменттер белсенділігін арттырады.

 

Егер рН автоматты түрде бақылау қиындалса, органикалық буферді пайдалануға болады, бұл буферлікті ортада рН 7,2 диапозонда сақтайды және диоксиль көмірсусыз да пайдалануға болады. HEPES-ті 10-25 мм концентрациясында қолдануға болады. Сонымен қатар жасанды орта дайындау үшін тұздардың гомогендік жағдайда болғаны өте мәнді роль атқарады. Егер жасушаларды осмос қысымы жоғары ортада ұстаса олардың көлемі азаяды және жарылады.

Ерітінділердің осмос қысымын лабораториялық жағдайда өлшеп оны қату нүктесімен салыстырады, қалыпты сывородкада оның мөлшері 0,50-0,65 бұл 0,28-0,30 атм қысымға сәйкес келеді, не 280-300 милиосмомольге тең. Осмос қысымын жасанды ортада Рингер сұйығымен өзгертуге болады, егер орта өте қаныққан болса, дистильденген сумен осмос қысымын қалыпқа келтіреді.

Жасанды ортаны байыну үшін нуклейн  қышқылдарының тектерін пайдаланады /аденин, гипоксатин, цистизин және тимидин/. Концентрациясы 10-10мм болу керек. Көптегне  орталарда микроптардың өсуін тоқтату үшін /ингибирование/ анртибиотиктер  қосады 100 ИЕ/мл пеницилин 50 ИЕ/мл стрептомицин. Қазіргі кезде альергиялық реакция болмау үшін пеницилиннің орнына тиімділігі жоғары 20 мкг/мл концентрациядағы гентомицин не 25 мкг/мл нистатинді қолданады.

Биологиялық орталардың ішінде ең кеңінен пайдаланатыны және жасушаларды  өсіруге тиімділеуі – ол сывородка. Қазіргі кезде анаулы жасанды орталарға тек  қана 5-20% қан сары суын /көлемі бойынша/  қолданады, өйткені бұл көлемдегі сарысу барлық уақытта жасушалардың өсуін және дамуын қолдайды. Сүт қоректілер ұрпақтарының тіршілігін, өсуін және дамуын іске асыратын сывородканың негізгі компоненттері 4.1 кестеде келтірілген.

Жасанды  ортада қан сарысуы жасушаларға төмендегіше қызмет көрсетеді: лабильді және суда еритін қоректі заттар үшін ортаның буферлілігін сақтайды, сондай – ақ пайда болған токсиндерді нитральдайды, гормондардың, пептиттік өсу факторларының көзі болады, төменгі молекулярлық басқа қажетті қоректік заттардың қамтамассыз етеді және протеза ингибиторы болады және қорғау тиімділігі басым.

Сонымен жоғарыда көрсетілген  орталардың үш категориясын бөлуге болады:

1. Қан сарысуы қосылған орта. Бұнда клеткаларды негізгі ортада өсіреді, оған белгілі бір сарысу алмастыратын компоненттер қосылуымен айрықшаланады.

2. Қан сарысуын оның аналогтарымен айырбастаған орта. Жасушаларды қан сывородкасын арнаулы компоненттермен алмастырған негізгі ортада өсіреді.

3. Қан сывородкасыз орталар. Бұлардың өздерін үш топшаға бөлуге болады: қарапайым не жай орталар /белоктар болмайды, 4.2 кесте/; арнаулы орталар /тазаланған белоктар және гормондар қосылады /; жартылай анықталған орталар /сарысуды анықталған биологиялық қосылыстармен байытады, мысалы пептон/.

Ең төменгі концентрациялы компоненттер құрамындағы орта яғни ұрпақтардың тіршілігіне, өсуіне және дамуына қажетті компоненттері аз мөлшерде бодлатын орта /4.2 кесте/.

 

3 Игл ортасы, компоненттері өте минимальды концентрацияда/МЕМ/.

Компоненттер	Мөлшері м/моль	Компоненттер	Мөлшері м/моль
Аминқынқылдары Аргинин Цистин Глутамин Гистидин Изолеицин Леицин Лизин Метионин Фенилаланин Тиронин Триптофан Тирозин Валин Көмірсу көздері Глюкоза Қосымшалар Қан сарысуы	0,6 0,1 2,0 0,2 0,4 0,4 0,4 0,1 0,2 0,4 0,05 0,2 0,4   5,5   5-10%	Витаминдер Холин Фолиев қышқылы Инозитол Никотинамид Пантотенад Рибофлавин Придоксаль Тиамин Органикалық емес иондар NaCl KCl CaCl2 MgCl26H2O NaH2PO42H2O NaHCO3	8.3 2.3 11.0 8.2 4.6 0.27 6.0 3.0     116 5.4 1.0 1.1 23.8 1.0

Орталарға  негізгі талғамы, оларды дпйындағанда компоненттерінің жақсы ерігіштігі токсиндердің жоқ болуы және стабильділігі /тұрақтылық/ болып табылады.

Лабораториялық жағдайда ерітінділерді 1 литр көлемінде дайындайды. Алдымен инртидиенттерді 700-800 мл суға ерітіп, сосын дистильдерген /3 рет/ сумен ортаның көлемін 1 литрге жеткізеді. Тұздардың барлығын кестеде көрсетілген ретпен ерітеді. Ал калий және магний /оларды еріту кезінде еруі қиын тұнбалар пайда болуына сәйкес/ өзінше бөлек ерітіп, сосын негізгі ортаға қосымша есебінде құйады. Амин қышқылдарының ішінде тирозин және  цистин ерітілуі қиын заттар болып  есептелінеді, сондықтан оны 0,1 нормальды /концентрациялық ерітінділер дайындау сондықтан оны 0,1 нормальды/ концентрациялық ерітінділер дайндау мақсатымен / да ерітеді. Ерітудің барлық  процедуралары аяқталған соң, яғни ингридиенттерді ерітуге байланысты процестер біткеннен соң жалпы орта көлемін бір литрге жеткізеді, содан кейін дайын болған сұйықты залалсыздандырады. Ол үшін милипоралық фильтрді /порасының размері 0,22 мкм/ қысымның күшімен пайдаланады, не автоклав тәсілімен залалсыздандырады. Оның режимі  атмосфер /115 С/ 10-15 минут  уақытта біріреді. Кейде негізгі олрта бөлек автоклавтан өткізіледі. Сонымен қатар кальций және магний тұзардың ертіндісінде жеке залалсыздандырады. Дайын сұйықты автоклавтан өткізген соң салқындатады, көмірқышқыл газын натрий биокарбонаты ерітіндісінен өткізеді. Сывородканың белок қосымшаларын /мысалы инсулин ж.б. гормондарды / -20С температурада сақтайды да бұларды жұмыс алдында ғана негізгі сұйыққа қосады. Сұйықтың буферлігін тұрақтылау үшін негізінен HEPES буферін /Т-2 гидрокислецилпиперазин –N –2 этильсульфан қышқылы / 1.0 М концентрациясында пайдаланады. Бұны қосу үшін алдын сұйылтады /1:50:0,02М/.

Қарапайым физиологиялық байланыстағы ерітінділерді негізінен эмбриондарды жуу алдында және цитологиялық, цитохимиялық зерттеулер жүргізгенде немесе эмриондарды  жасанды ортада өсіру алдында шаюға қолданады /4.3 кесте/.

Практика жүзінде кейбір орталар ұрықталыну процестерінде кеңінен қолданылады кейбіреуі өсіру, көбейту /культивирование/  үшін пайдаланады, әсіресе пробирка /in vitro/ жағдайында / 4.4 кесте/ басқалары имплантация алдындағы кезеңдердң өсіру үшін керек /4.5 кесте /.

Өте төменгі температурада ұрпақтарды және овоциттарды қатыру процесінде /криоконцервациялау/ жасушалық денелерді бұзылудан, жарылудан, ісінуден , солудан сақтау үшін тұрақты рН ұстайтын ортада қатыру керек. /айталық, өте ұзақ мезгілде овоциттар және эмбриондар бақылаусыз стихиялы ұзақ уақыт бойы рН және буфердлік өзгерістер құрсауында болады/. Оның көрсеткіші ауада қатыру керек сондықтан келтірілген арнаулы орталар РВ-1 және М-2 энергия көздерімен байытылған. Олар: пируваттар, глюкоза және бұқа қан сары су альбумині.

Одан басқа, М-2 лактатымен байытылған орта эмбриондарды метаболиттік пұлдың азаюына жол бермейді және кері әсерлерден сақтайды.

 

4. Овоциттарды in vitro ұрпақтандырылуға арналған орталар.

Компоненттік заттар	Орталар
	Т6		Кребс – Рингердің биокарбонатты ерітінділері		Тышқандар овоциттерін ұрықтандыруға арн. орта
	Г/л	мМ	Г/л	мМ	Г/л	ММ
Na Cl KCl MgCl26H2O N2HPO412H2O CaCl22H2O KH2PO4 MgSO4H3O NaHCO3 Қосымша қосатындар: Na лактаты Na пируваты Глюкоза Бұқа қан сарысу альбумині/БСА/ Стрептомицин сульф Пенициллин Қызыл фенол	5,719 0,106 0,096 0,129 0,262 - - 2,101   2,791 0,052 1,0 -   0,050   0,060 0,010	97,84 1,42 0,47 0,36 1,78 - - 25,0   24,90 0,47 5,56 -	5,52 0,356 - - 0,251 0,162 0,293 2,106   6,045 0,056 1,0 4,0   5,050   0,075 -	94,6 4,78 - - 1,71 1,91 1,91 25,07   21,58 0,50 5,56 -	6,976 0,356 - - 0,382 0,293 0,293 2,106   - 0,110 1,0 4,0   0,050   0,75 -	119,67 4,78 - - 1,19 1,19 1,19 25,07   - 1,0 5,56 -
Ескерту:Барлық қосымшалар тек қан жұмыс алдында қосылады.